Con el propósito de ganar almas para Dios, los misioneros acompañaron a Pedro Menéndez de Avilés en su viaje para establecer San Agustín en 1565, encontrándose con una amplia variedad de modelos de colonización, lenguas indígenas, y ambientes. La actitud de los nativos hacia los misioneros en la Florida española había sido influenciada por los previos encuentros con los españoles, de los que solo algunos están documentados. Los nativos del norte de Florida y de la costa de Georgia eran más receptivos a las misiones que los del sur. Los indígenas de las tribus timucua y apalache eran de naturaleza más sedentaria y participaban en una amplia red de comercio prehistórico por lo cual eran más abiertos a los extranjeros. La mayoría de las misiones en la Florida española durante los siglos XVI y XVII, se establecieron entre estos grupos.
La primera misión fundada en norteamérica al norte de México, fue Nombre de Dios, en el actual San Agustín. A diferencia de las misiones de California, fundadas posteriormente, las misiones de Florida no minaron intencionadamente las tradiciones de los nativos. Las misiones (doctrinas) y dependencias (visitas) se establecieron en las villas nativas ya existentes, cerca de las rutas que luego fueron el Camino Real de los españoles que conectaba las misiones entre sí. La Corona sostenía a los caciques y sus territorios, aunque los españoles intensificaban las demandas de comida, mano de obra y asistencia militar.
La naturaleza dispersa del establecimiento de las misiones de los españoles en Florida era un factor favorecedor, ya que permitía a los frailes proteger a los indígenas que tenían a su cargo del abuso de los soldados y civiles españoles. Los españoles estaban conscientes de ser una minoría que podía ser aplastada por los indígenas y que no tenían control total sobre la población nativa y esto los obligó a ser más tolerantes.
Aunque los Timucua eran los más numerosos, por su proximidad con San Agustín, fueron los primeros en sufrir las enfermedades y el exceso de trabajo causando la muerte a gran parte de la población. En 1633 se establecieron las misiones requeridas por los jefes de las provincias Apalaches, para abastecer y proporcionar mano de obra a San Agustín. Los franciscanos lograron su mayor éxito entre las misiones de Apalaches. Cuando el Obispo Calderón visitó las misiones de Florida en 1675, la mayoría pertenecía a la provincia de Apalache.
Desde 1661 y más aún con el establecimiento de Charleston en 1670, las misiones de Guale fueron sistemáticamente destruidas por los grupos de nativos aliados a los ingleses. En 1702, durante el asedio de San Agustín por 50 días, James Moore saqueó la ciudad, pero no pudo derribar los muros del castillo ni hacer daño a los españoles secuestrados en el interior, decidiendo entonces atacar las misiones españolas más vulnerables. Entre 1702 y 1706, casi todas las misiones de Florida fueron destruidas y el resto de los nativos americanos de la Florida española ejecutados, esclavizados o exiliados. El historiador Michael Gannon declaró que la destrucción de las misiones de Florida fue uno de los episodios más trágicos en la historia del Sur.
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