Sin embargo el colonialismo no fue bueno para ellos. Las enfermedades, la esclavitud, la guerra y el descenso de la natalidad diezmaron la población y les causaron grandes sufrimientos.
En 1512 se le concedió a Juan Ponce de León un privilegio real por el cual se le autorizaba a explorar y a colonizar; también se le adjudicaban los nativos americanos para que le sirviesen como esclavos. En el tiempo de Pánfilo de Narváez (1528) y Hernando de Soto (1539) los nativos americanos fueron declarados libres, súbditos de la Corona Española, quienes debían de ser instruidos en el catolicismo. Aquellos que se resistiesen se les podía castigar con la muerte. Debido a las dificultades que los conquistadores encontraron en Florida, todos estos mandatos fueron ignorados, no logrando convertir ni a un nativo.
Después de la fundación de la colonia Florida, Pedro Menéndez de Avilés y sus sucesores trajeron el primer jesuita y los primeros misioneros franciscanos para administrar a los Timucua y Apalaches en el norte de Florida. A través del siglo XVII las misiones fueron el primer campo de interacción entre los nativos americanos de Florida y la colonia española. La mayoría de los nativos vivían al sur de las misiones, en el centro y sur de Florida alejados de San Agustín, sin embargo, no pudieron evadir los estragos de las epidemias.
En las misiones, la vida y costumbres de los nativos iban cambiando a medida que se iban convirtiendo al cristianismo y adoptaban nuevas creencias, practicas religiosas y nombres españoles. Los líderes religiosos de los nativos cedieron el camino a los sacerdotes católicos. Nuevas cosechas, como melones de agua, melocotones, higos, avellanas, naranjas y garbanzos, eran cultivadas en las misiones y algunos nativos criaron pollos. Otros aprendieron a leer y a escribir el español. Los nativos valoraban las herramientas de hierro españolas, las cuentas de cristal, la ropa y otros bienes. Aún así, los nativos continuaban con sus métodos tradicionales, como por ejemplo en la construcción de las casas.
Los nativos que vivían en las misiones proveían mano de obra a la colonia de Florida. Ayudaban en la construcción de las casas de los españoles, mejoraban y mantenían las rutas, trabajaban en San Agustín como sirvientes, en las granjas y en las minas de coquina, para la construcción del castillo de San Agustín. El cultivo de los campos de maíz era una actividad de gran importancia ya que estas cosechas abastecían los mercados españoles de San Agustín. No es exagerado decir que la colonia española descansaba en los hombros de la misión nativa americana.
En San Agustín algunos españoles se casaron con nativas. En los descubrimientos arqueológicos se han encontrado artículos de barro usados por los nativos, sugiriendo que integraron algunas comidas y técnicas de preparación en sus dietas.
A finales del siglo XVII y principios del XVIII, después de la destrucción y abandono de las misiones del norte de Florida, los nativos que sobrevivieron fueron diezmados por las redadas de esclavos y otros depredadores. Alrededor del 1720, doscientos años más tarde de la fundación de San Agustín, los descendientes de aquella gente que presenciaron la llegada de los españoles a sus costas, habían desaparecido.
Florida es una vez más, el hogar de un número significativo de la población nativa americana, que se trasladó a Florida desde 1750, todos ellos descendientes de los seminoles, miccousukee y creek. Desde 1900 Florida es el hogar de miles de nativos americanos.