En 1513 Ponce de León desembarcó en la costa este de Florida en algún lugar entre el 'St Mary's River' y Cape Canaveral marcando así el comienzo del período de la España Colonial en Florida.

Cuando Pedro Menéndez de Avilés desembarcó en 1565 y estableció una colonia llamada San Agustín, fundó lo que es hoy la ciudad europea más antigua de América del Norte. San Agustín servía como una importante avanzada de defensa para la flota española, que cargaba oro y plata de las Americas a España y como centro para las incursiones al interior de Florida.

Desde San Agustín, Menéndez y sus sucesores desarrollaron un sistema de misiones, que se extendió por el norte, sur y oeste convirtiendo a los nativos americanos al catolicismo y estableciendo avanzadas españolas y colonias a través del norte de Florida.

Aunque España mantenía un fuerte control sobre Florida durante la mayor parte del siglo XVII, Inglaterra y Francia amenazaban constantemente la colonia española desde sus colonias respectivas, al norte y oeste de Florida. También los piratas atacaban los pequeños pueblos coloniales. En 1672 el Castillo de San Marcos fue construido para defender la colonia. En 1672 los británicos quemaron todo San Agustín menos el fuerte. Hacia 1706 ellos habían destruido la mayoría de las misiones entre la ciudad y la misión de San Luís de Apalache, en lo que es hoy Tallahassee, terminando definitivamente con el período de las misiones. A pesar de esta pérdida, San Agustín y Florida permanecieron en manos de los españoles, protegidas por el Fuerte Matanzas al sur y el Fuerte Mosé, al norte, hasta el 1763, en el que los británicos ganaron Florida por un tratado. La mayoría de los residentes españoles se marcharon a Cuba.

Durante el período británico, San Agustín vio la influencia de varios grupos de inmigrantes mayormente menorquines, aunque también de griegos e italianos llegados de "Turnbull", una plantación cerca de lo que es hoy New Smyrna, que había fracasado. Como capital de una de las 14 colonias británicas y la única de América del Norte, San Agustín servía también de refugio a todos los que eran leales a la corona británica durante la "Revolución Americana". Con la derrota de los británicos, el poder español vuelve al este de Florida y a San Agustín, su capital, en 1783. San Agustín era una ciudad políglota y de muchas culturas durante el segundo período español. El inglés se escuchaba en las calles casi tanto como el español.

La mayoría de los súbditos británicos, abandonaron Florida cuando los españoles tomaron de nuevo el control, aunque muchos otros se quedaron para hacerse ciudadanos españoles, incluidos los de la plantación "Turnbull". Los residentes españoles que habían evacuado San Agustín en 1764, volvieron para reclamar las casas y propiedades que habían dejado atrás, demandando a los residentes del período británico. Los negros esclavos y libres nacidos en América o los recién llegados de África, México, Cuba y Santo Domingo también vivían y trabajaban en San Agustín.

Así como en el primer período español, "el situado" (sueldo militar) asignado por la Corona española, proveía la mayor contribución a la economía de San Agustín. Después de la ocupación de España por Napoleón Bonaparte, en 1808, los fondos para las colonias españolas desaparecieron. La economía se sostenía por las exportaciones de madera para la construcción, carne y frutos cítricos, a los puertos españoles, británicos y americanos, y a su vez llegaban barcos de Nueva York, Baltimore, Liverpool, La Habana y Veracruz trayendo cargamentos de telas, enseres de cocina, vino y noticias. Los gobernadores de Florida recurrían a las milicias locales, para suplir la falta de soldados. Los menorquines, españoles y negros, formaban sus propias unidades de milicia para proteger a San Agustín.

La religión oficial de la colonia volvió a ser de nuevo la Católica Romana. Una de las adiciones más importantes a San Agustín, durante el segundo período español fue la iglesia parroquial, construida en el lado norte de la plaza, entre el 1793 y 1797 a donde se alza hoy la Catedral- Basílica de San Agustín. Después del fuego que quemó por completo San Agustín en 1702, la congregación parroquial tuvo al fin su propia iglesia, después de varias décadas de estar celebrando los servicios religiosos en un local temporal. Las paredes de la iglesia y las casas de mayor importancia del pueblo fueron construidas a base de "coquina" una piedra local incrustada de conchas de mar. Alrededor de dos docenas de edificios coloniales del San Agustín de hoy en día, se originaron en el segundo período español, incluyendo el Castillo de San Marcos. Las paredes exteriores de todos los edificios, menos uno, son de piedra de "coquina".

San Agustín, desde un principio, fue un lugar de refugio. Residentes de las afueras, del este de Florida, se refugiaban en San Agustín cuando se veían amenazados por americanos, redadas de seminoles o ataques de piratas. En el verano de 1821, los soldados españoles y sus familias evacuaron a San Agustín cuando España cedió la colonia a los Estados Unidos. Pero la mayoría de la población de la ciudad – menorquines, residentes naturalizados que inmigraron del sur de los Estados Unidos, negros esclavos y libres, se quedaron y formaron lo que es hoy el corazón de la población americana.